Una interfaz electrogenética para programar la expresión de genes de mamíferos mediante corriente continua.

Metabolismo de la naturaleza (2023)Citar este artículo

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Los dispositivos electrónicos portátiles están desempeñando un papel cada vez más importante en la adquisición de datos de salud de las personas para intervenciones médicas personalizadas; sin embargo, los dispositivos portátiles aún no pueden programar directamente terapias basadas en genes debido a la falta de una interfaz electrogenética directa. Aquí proporcionamos el eslabón perdido mediante el desarrollo de una interfaz electrogenética que llamamos tecnología de regulación accionada por corriente continua (CC) (DART), que permite la expresión transgénica mediada por electrodos, dependiente del tiempo y del voltaje en células humanas que utilizan CC de baterías. DART utiliza un suministro de CC para generar niveles no tóxicos de especies reactivas de oxígeno que actúan a través de un biosensor para ajustar de forma reversible los promotores sintéticos. En un estudio de prueba de concepto en un modelo de ratón macho con diabetes tipo 1, una estimulación transdérmica una vez al día de células humanas microencapsuladas implantadas por vía subcutánea mediante agujas de acupuntura energizadas (4,5 V CC durante 10 s) estimuló la liberación de insulina y restableció la normoglucemia. Creemos que esta tecnología permitirá que los dispositivos electrónicos portátiles programen directamente intervenciones metabólicas.

Los dispositivos electrónicos inteligentes interconectados dominan cada vez más nuestra vida diaria y moldean nuestra conciencia sobre la salud1; sin embargo, los sistemas electrónicos y biológicos funcionan de maneras radicalmente diferentes y son en gran medida incompatibles debido a la falta de una interfaz de comunicación funcional. Mientras que los sistemas biológicos son analógicos, programados por la genética, actualizados lentamente por la evolución y controlados por iones que fluyen a través de membranas aisladas, los sistemas electrónicos son digitales, programados por software fácilmente actualizable y controlados por electrones que fluyen a través de cables aislados. Las interfaces electrogenéticas que permitirían a los dispositivos electrónicos controlar la expresión genética siguen siendo el eslabón perdido en el camino hacia la total compatibilidad e interoperabilidad de los mundos electrónico y genético2.

La biología sintética ha asumido este desafío ensamblando interruptores genéticos analógicos simples en circuitos genéticos complejos que pueden programar el comportamiento celular con la funcionalidad de procesamiento lógico de circuitos electrónicos como osciladores3, temporizadores4, memorias5, filtros de paso de banda6 e interruptores de relé7, así como analógicos. convertidores a digital8, semisumadores9 e incluso sumadores completos10. La utilidad de muchos de estos circuitos genéticos se ha demostrado en el control experimental de diversas afecciones médicas, incluido el cáncer3, las infecciones bacterianas11, el dolor crónico12 y la diabetes13. Los circuitos genéticos suelen incorporar interruptores genéticos inducibles por desencadenantes que están controlados por compuestos de pequeño peso molecular, como antibióticos14, vitaminas15, aditivos alimentarios16, cosméticos17 o fragancias volátiles8. Dado que las diferencias en la biodisponibilidad, los efectos secundarios pleiotrópicos y la farmacodinamia pueden poner en peligro el desempeño regulador general de tales desencadenantes en un huésped mamífero, la atención se ha centrado cada vez más en señales físicas no moleculares sin rastro, como las ondas electromagnéticas, incluida la luz18,19, los campos magnéticos20 y las ondas de radio21. y calor22; sin embargo, los interruptores genéticos activados físicamente pueden requerir un alto aporte de energía21, pueden involucrar cofactores químicos o inorgánicos no fisiológicos con efectos secundarios19, biodisponibilidad deficiente23 o vidas medias cortas24, pueden sufrir citotoxicidad basada en la iluminación25 y pueden confundirse con cualquier afección médica asociada a la fiebre22.

Por lo tanto, existe la necesidad de un dispositivo que permita el ajuste fino eléctrico directo de la expresión de genes de mamíferos, alimentado por baterías, sin cofactores, dependiente del tiempo y del voltaje, para preparar el escenario para la expresión de genes electrocontrolados basados ​​en dispositivos portátiles con el potencial conectar las intervenciones médicas a un internet del cuerpo o internet de las cosas. Los intentos pioneros de diseñar la expresión genética electroinducible en bacterias26,27,28,29,30 y células de mamíferos31,32,33 resultaron prometedores en cultivos celulares, pero fueron incompatibles con aplicaciones in vivo debido a la citotoxicidad, la biodisponibilidad limitada y la mala clínica. compatibilidad de compuestos redox electrosensibles26,31 o corriente alterna de alto voltaje controlada por complejos implantes bioelectrónicos con longevidad limitada32. Dichos dispositivos no son adecuados para su uso en dispositivos portátiles que funcionan con baterías para programar la expresión de transgenes terapéuticos en células implantadas32.

En humanos, las especies reactivas de oxígeno (ROS) se producen por reacciones de transferencia de electrones durante procesos respiratorios en las mitocondrias y peroxisomas, durante la actividad del citocromo P450 mitocondrial en tejidos esteroidogénicos y por la NADPH oxidasa en células inmunes durante las respuestas inmunes34. La proteína 1 asociada a ECH similar a Kelch (KEAP1) es un importante supresor de tumores y metástasis que también actúa como un biosensor de ROS nativo35. En condiciones de reposo, KEAP1 secuestra y prepara el factor nuclear eritroide 2 relacionado con p45 (NRF2) para la destrucción proteasomal35. En presencia de ROS elevados, KEAP1 libera NRF2, que se traslada al núcleo para coordinar las respuestas antioxidantes y antiinflamatorias mediante la unión a elementos de respuesta antioxidante (ARE)35.

Inspirándonos en el hecho de que los electrodos que suministran CC a bajo voltaje pueden generar rápidamente electrones libres y especies radicales que conducen a la producción de ROS sin mediadores a niveles bajos y no citotóxicos36,37,38, nos propusimos diseñar el eslabón perdido para la CC. Modulación de genes diana electrogenéticos impulsada por células humanas, a la que nos referimos como tecnología de regulación accionada por CC (DART). Recientemente se aplicó la generación de peróxido de hidrógeno basada en CC para establecer un sistema electrogenético utilizando células bacterianas diseñadas que crecen en la superficie de un electrodo, que fue capaz de activar la expresión transgénica mediante estimulación eléctrica30. Aquí diseñamos una interfaz electrogenética que consta de componentes genéticos que hacen que las células humanas respondan a la electroestimulación activada por CC y permiten la expresión transgénica exclusiva y ajustable por CC. Inicialmente descubrimos que los niveles de ROS producidos en células de riñón embrionario humano (HEK293) mediante exposición a 4,5 V CC durante 10 s no eran suficientes para activar sustancialmente KEAP1/NRF2; sin embargo, las células podrían hipersensibilizarse a las ROS electroinducidas mediante la expresión ectópica de KEAP1 y NRF2 nativos. Luego, volver a cablear NRF2 a promotores sintéticos que contienen ARE permitió un ajuste fino directo y sin cofactores de la expresión de transgenes terapéuticos, como el gen de la insulina, impulsado por CC. Como prueba de concepto, implementamos el control remoto de la expresión de insulina basado en DART en ratones diabéticos tipo 1. La estimulación de células diseñadas implantadas por vía subcutánea con electrodos de aguja de acupuntura aprobados por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y autorizados por la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) de EE. UU. a 4,5 V CC durante 10 s una vez al día desencadenó la producción de suficiente insulina para atenuar las excursiones glucémicas posprandiales. y restaurar la normoglucemia.

Para sensibilizar células humanas nativas para el control de la expresión del transgén mediado por ROS electroestimulado, cotransfectamos células de riñón embrionario humano (HEK293) con vectores de expresión constitutivos KEAP1 (pJH1004, PhCMV-KEAP1-pA) y NRF2 (pJH1003, PhCMV-NRF2-pA). así como la construcción informadora pJH1005 (PDART-SEAP-pA; PDART, OARE-PhCMVmin) que codifica la glicoproteína modelo humana SEAP (fosfatasa alcalina secretada por la placenta humana) bajo el control de un promotor sintético dependiente de NRF2 que contiene un sitio operador ARE (suplementario Tabla 1). Los protones y los iones de cloro se generan en el medio de cultivo celular en los electrodos36,37 (Fig. 1a) y conducen a la producción de ROS en niveles38 que pueden desencadenar la liberación de NRF2 de KEAP1, lo que resulta en la expresión mediada por NRF2 de un gen de interés del promotor PDART sintético específico de NRF2 (Fig. 1b).

a, Ilustración esquemática de la configuración de estimulación para cultivos monocapa. Cada pocillo de una placa de 24 pocillos tiene dos alambres de platino que funcionan como ánodo y cátodo, colocados a 0,6 cm de distancia y sumergidos en el medio de cultivo. Cuando se aplica corriente eléctrica, se forman burbujas alrededor de los electrodos, con producción de cloro gaseoso en el ánodo e hidrógeno gaseoso en el cátodo. b, Representación esquemática del circuito electrogenético basado en la respuesta antioxidante NRF2/KEAP1. Tras la estimulación eléctrica, la formación de ROS es detectada por los complejos NRF2 y KEAP1 expresados ​​constitutivamente localizados en el citoplasma, lo que desencadena la translocación de NRF2 al núcleo, donde activa la expresión del gen de interés uniéndose a sitios ARE en el sistema sintético aguas arriba. promotor. En condiciones no estimulantes, NRF2 se dirige continuamente al proteosoma 26S para su degradación. c, SEAP producido por células HEK293 transfectadas transitoriamente (KEAP1, pJH1004; NRF2, pJH1003; PDART-SEAP, pJH1005) tras estimulación por CC con 10 V durante 15 s (DC10V) y 5 V durante 20 s (DC5V). d, SEAP producido por células transfectadas solo con el indicador ARE (PDART-SEAP, pJH1005) o junto con las variantes KEAP1 (pJH1004) y NRF2 (NRF2 de tipo salvaje, pJH1003; NRF2-VP64, pJH1175) y el indicador (pJH1005). Las células fueron estimuladas con DC5V durante 20 s. e, SEAP producido por células cotransfectadas con KEAP1 (pJH1004), NRF2 fusionado al transactivador dependiente de tetraciclina TetR-VP64 (NRF2-TetR-VP64, pJH1181) y el informador afín (PTRE-SEAP-pA, pMF111). Las células fueron estimuladas con DC5V durante 20 s. f, SEAP producido por células cotransfectadas con construcciones informadoras que contienen una (DART1), dos (DART2), tres (DART3) y cuatro (DART4) ARE repeticiones en la región promotora y estimuladas con DC5V durante 20 s. Los datos son media ± sd, n = 4. Los valores de P se calcularon entre los controles estimulados y no estimulados.

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Para la electroestimulación, las células diseñadas se cultivaron en placas estándar de 24 pocillos que contienen tapas personalizadas que sirven para sumergir electrodos de platino de 0,5 mm en el medio de cultivo a una distancia de separación de 6 mm (Fig. 1a, Fig. Suplementaria 1a, b y Suplementaria). Vídeo 1). Observamos un aumento significativo de la expresión de SEAP tras la electroestimulación con CC a 10 V durante 15 so 5 V durante 20 s (Fig. 1c). Los programas de pulsos de corriente alterna (CA) que entregan energía similar a estos programas de CC (por ejemplo, pulsos de 1 ms de 5 V a 1 Hz durante 2,78 h) dieron como resultado un aumento de menos del doble en la expresión de SEAP y una disminución significativa de la viabilidad celular ( Figuras complementarias 1c-f y 2). De hecho, para alcanzar niveles de expresión de SEAP comparables, la estimulación de CA debe entregar más energía y ejecutarse durante períodos de tiempo más largos (6 h para pulsos de 1 ms (Figura complementaria 2c); o más de 1 h para pulsos de 10 ms (Figura complementaria 2c); 2e)), nuevamente con un impacto negativo en la viabilidad celular (Figuras complementarias 1c-f y 2). Por lo tanto, de ahora en adelante nos centramos en el CC como nuestra única fuente de energía. En particular, los programas de estimulación de CC por debajo de 5 V y 20 s no tuvieron impacto en la viabilidad celular (Figuras complementarias 2 y 3a), la composición del medio (Figuras complementarias 3b-e y Tablas complementarias 2-5), la cinética de crecimiento o la capacidad general de producción de proteínas. de células estimuladas (Figura 4 complementaria), lo que indica que la electroestimulación mediada por CC puede reconectarse específicamente a los promotores DART para ajustar la expresión transgénica en células humanas. Las células HEK293 electroestimuladas transfectadas exclusivamente con pJH1005 mostraron sustancialmente menos inducción de SEAP, lo que indica que la coexpresión concomitante de KEAP1 y NRF2 aumenta la sensibilidad de las células humanas a la producción de ROS electroestimulada (Fig. 1d). También probamos si NRF2 fusionado al fuerte dominio de transactivación VP64, que se basa en cuatro repeticiones en tándem del activador transcripcional temprano VP16 del virus del herpes simple (pJH1175, PhCMV-NRF2-VP64-pA), podría aumentar aún más la respuesta electroestimulada; sin embargo, esta modificación aumentó la expresión de SEAP tanto basal como electroestimulada, lo que resultó en un pliegue de inducción general sustancialmente menor (3,7 ×) en comparación con el NRF2 nativo (7,2 ×) (Fig. 1d). Asimismo, observamos una inducción de veces menor (3,9 ×) de NRF2 fusionado al transactivador dependiente de tetraciclina TetR-VP64 (pJH1181, PhCMV-NRF2-TetR-VP64-pA) que activa la expresión de SEAP de un promotor que contiene elementos de respuesta a tetraciclina (TRE). (pMF111, PTRE-SEAP-pA; PTRE, OTetR-PhCMVmin) (Fig. 1e). Análisis adicionales con variantes de PDART que contienen diferentes repeticiones en tándem de ARE revelaron que una sola repetición de ARE proporcionó una expresión basal baja pero también el nivel de expresión máximo más bajo, mientras que más repeticiones en tándem lograron niveles de expresión máximos sustancialmente más altos a expensas de una expresión basal más alta (Fig. 1f). . Por lo tanto, la prioridad para la filtración más baja o el nivel de expresión más alto determinará la elección de las variantes de PDART, como también ocurre con otras modalidades de control de la transcripción39.

Un ensayo basado en fluorescencia mostró que los niveles de ROS intracelulares aumentaron más del doble 1 h después de la electroestimulación con CC a 5 V durante 20 s y regresaron a niveles no estimulados dentro de las 6 h, lo que sugiere que la expresión de SEAP electroestimulada estaba mediada por ROS36. 37,38 (Datos ampliados, figura 1a). En particular, las células tratadas con el eliminador de ROS N-acetil-L-cisteína (NAC) 40 no lograron aumentar la expresión de SEAP tras la electroestimulación (Datos ampliados, Fig. 1b, c). Por el contrario, las células tratadas con inhibidores de diferentes enzimas generadoras de ROS, como GKT136901, AEBSF, ML171 y VAS2870 (ref. 41), aún podrían responder a la electroestimulación aumentando la expresión de SEAP (Datos ampliados, Fig. 1b, c), lo que respalda la consideran que la generación de ROS resulta de la estimulación de energía de CC en lugar de fuentes endógenas. Además, aunque el peróxido de hidrógeno (H2O2), el oltipraz, el dibromuro de diquat42 y la aspirina43 pueden inducir aumentos repentinos de ROS en las células, el sistema DART no mostró respuesta SEAP a estos químicos (Datos ampliados, figura 2), lo que sugiere que DART no responde a los radicales libres. generados por estos químicos (por ejemplo, radicales hidroxilo (•OH) del tratamiento con H2O244). Por el contrario, la electroestimulación CC genera electrones libres que pueden ser recibidos por diferentes moléculas para formar una gama más amplia de radicales y algunos de ellos pueden desencadenar el sistema DART al activar la expresión transgénica del promotor sintético PDART. También analizamos la corriente resultante, los niveles de ROS, la respuesta de SEAP y el impacto en la viabilidad celular cuando los voltajes de CC aplicados se midieron en una configuración de tres electrodos que incorporaba un electrodo de referencia Ag/AgCl, demostrando así la capacidad de ajuste del sistema DART in vitro ( Datos ampliados Fig. 3). La secuenciación de próxima generación reveló que la electroestimulación CC a 5 V durante 10 s tuvo un impacto insignificante a nivel del transcriptoma, pero 5 V durante 25 s tuvo un ligero efecto, con un pequeño conjunto de genes asociados principalmente con la respuesta antioxidante que se expresan diferencialmente en comparación con los no. -células estimuladas (Datos ampliados, figura 4 y lista complementaria). Estos resultados indican que los tiempos de estimulación <25 s no interfieren con el control de DART y todos los experimentos de seguimiento se realizaron en consecuencia.

El perfilado de los niveles de expresión del transgén después de la electroestimulación con CC dependiente del voltaje durante 15 s reveló niveles de expresión similares entre 5 y 12,5 V, mientras que los voltajes más altos generaron niveles más altos de ROS que disminuyeron la viabilidad celular (Fig. 2a y Fig. Suplementaria 5a). Con la potencia de CC establecida en 5 V, el nivel de expresión del gen objetivo se pudo ajustar con precisión (Fig. 2b y Fig. Suplementaria 5b, c) y se mantuvieron distintos perfiles de inducción durante períodos de tiempo más largos (Fig. 2c), durante cuyo análisis microscópico de fluorescencia de lapso de tiempo correlacionado de la proteína fluorescente verde mejorada no mostró fugas sustanciales del sistema DART (Figuras complementarias 5d-f y Videos complementarios 2 y 3). Sin embargo, los tiempos de exposición superiores a 30 s redujeron significativamente tanto la viabilidad celular como la expresión de SEAP (Figuras complementarias 5g, h), probablemente como resultado de las burbujas de gas y los cambios de pH que se produjeron en los electrodos (Figuras complementarias 6a-e). La cinética de inducción reveló niveles significativos de producción de proteínas electroestimuladas en el sobrenadante del cultivo dentro de las 4 h (Fig. 2d), lo que es consistente con el comportamiento de las células secretoras profesionales32. Además, el control de la expresión del transgén impulsado por CC fue completamente reversible, mostrando perfiles de inducción y represión similares durante varios ciclos de conmutación de ENCENDIDO a APAGADO y de APAGADO a ENCENDIDO (Fig. 2e).

a, b, niveles de SEAP 24 h después de la estimulación eléctrica en sobrenadantes de cultivo de células HEK293 cotransfectadas con las construcciones DART (pJH1003, pJH1004 y pJH1005). Estimulación durante 15 s a los voltajes indicados (a), o con 5 V DC durante los periodos de tiempo indicados (b). c, Cinética de producción de SEAP durante 72 h mediante células diseñadas expuestas a 5 V CC durante los períodos de tiempo indicados. Los factores de inducción se calcularon entre el grupo estimulado y no estimulado a los 25 s. d, SEAP producido en 6 h por células diseñadas por DART después de la exposición a 5 V CC durante 20 s. Los factores de inducción se calcularon entre los grupos indicados. e, Reversibilidad del interruptor DART. Las células diseñadas se cultivaron alternativamente durante ciclos de 24 h en medio sin electroestimulación (OFF) o se trataron con 5 V CC durante 20 s (ON) y se midió la producción de SEAP en los sobrenadantes del cultivo. Cada 24 h se cambió el medio de cultivo y se reajustó la densidad celular. f, SEAP producido por diferentes líneas celulares de mamíferos transfectadas transitoriamente con las construcciones DART y estimuladas con 5 V CC durante 20 s. Se utilizaron cultivos no estimulados como controles. Todos los datos son medias ± DE; n = 4. Los valores de P se calcularon entre el control estimulado y no inducido. Las designaciones estadísticas con diferentes colores se refieren a los puntos de datos correspondientes con el mismo color (c).

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Para evaluar más a fondo la versatilidad del sistema DART, transfectamos transitoriamente un conjunto de líneas celulares de mamíferos (Fig. 2f). A pesar de las variaciones en la eficiencia de la transfección11 y la sensibilidad a ROS, lo que resulta en diferentes veces de inducción y niveles máximos de expresión, la funcionalidad de DART se validó en todas las líneas celulares analizadas, incluida la línea celular derivada de células madre mesenquimales humanas (hMSC-TERT), lo que sugiere que DART será compatible con una amplia gama de aplicaciones (Fig. 2f y Fig. complementaria 6f). Teniendo en cuenta los niveles de inducción de veces, expresión basal y máxima, seleccionamos células HEK293 y hMSC-TERT para usar en experimentos de seguimiento (Fig. 2f).

Para comprobar la idoneidad de las fuentes de alimentación de CC ampliamente disponibles, así como la compatibilidad con dispositivos electrónicos portátiles y portátiles, a continuación examinamos la electroestimulación de la expresión genética utilizando suministros de CC estándar disponibles en el mercado, como baterías alcalinas, pilas de botón, cargadores móviles y dispositivos portátiles. bancos de energía. Primero probamos una, dos y tres baterías AA y AAA de 1,5 V que proporcionan 1,5, 3 y 4,5 V cuando se conectan en serie, respectivamente. Aunque los voltajes <3 V requirieron tiempos de inducción más prolongados, de 2 a 60 min, para producir suficiente ROS para desencadenar niveles significativos de SEAP, la estimulación con tres baterías AA o tres AAA durante 10 s fue suficiente para inducir la expresión de SEAP, que alcanzó su punto máximo a los 25 s de estimulación. Fig. 3a – c y Datos ampliados Fig. 5a – c), que muestran perfiles de inducción comparables a los generados por una fuente de alimentación de 5 V.

a–c, una (a), dos (b) y tres (c) pilas alcalinas Duracell o Energizer AA de 1,5 V. d, Dos pilas de botón de litio Duracell o Energizer (CR2032) proporcionan aproximadamente 6 V. e, Una pila alcalina de bloque Duracell o Energizer de 9 V. f, Una batería Exell A220/504 A. Los niveles de SEAP se midieron 24 h después de la estimulación. Todos los datos son medias ± DE; n = 4. Los valores de P se calcularon entre el control estimulado y no inducido.

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La batería de botón de litio CR2032 de 3 V, que se usa ampliamente para impulsar dispositivos portátiles, desencadenó la expresión SEAP en hasta 30 minutos, mientras que una configuración en serie de 6 V de dos CR2032 programó niveles máximos de expresión SEAP en <20 s (Fig. Datos 3d y ampliados Fig. 5d). Además, una configuración en serie de 6 V alimentada por cuatro baterías AA o cuatro AAA produjo perfiles de expresión de proteínas comparables a los generados por la configuración 2 × CR2032, corroborando la dependencia del voltaje del interruptor genético electrogenético independientemente del tipo de fuente de energía ( Datos ampliados Fig. 5e,f). Esto se confirmó aún más mediante el uso de un cargador de teléfono móvil y un banco de energía que normalmente proporciona una salida de 5 V (Datos ampliados, Fig. 5g,h).

También probamos baterías de mayor voltaje, incluidas baterías de bloque de 9 V, alcalinas de 12 V 23 A y baterías Exell A220 504 A de 15 V en forma individual (Fig. 3e, f y Datos extendidos Fig. 5i) o en tándem en serie (Datos extendidos Fig. 5i). .5j–l) configuraciones. Las mediciones de la expresión de SEAP confirmaron una correlación inversa entre el voltaje (1,5 a 30 V) y los tiempos del nivel máximo de expresión (5 sa 60 min) en todas las fuentes de alimentación de CC (Fig. 3e, f y Datos ampliados Fig. 5i-l). En particular, ninguna de las configuraciones de batería probadas afectó sustancialmente la viabilidad de la celda durante los tiempos de estimulación indicados (Figuras complementarias 7 y 8), lo que confirma que la interfaz electrogenética alimentada por CC es robusta, segura y ajustable en una amplia gama de voltajes y tipos de baterías. y tiempos de estimulación.

Como prueba de principio desafiante in vivo, elegimos tratar la diabetes tipo 1 experimental (DT1), porque la diabetes es una enfermedad crónica que muestra una prevalencia dramáticamente creciente a nivel mundial y requiere un manejo dinámicamente exigente45. Para el control sensible a DC de la producción y liberación de insulina, establecimos líneas celulares estables HEK293 y hMSC-TERT diseñadas para la expresión constitutiva de KEAP1 (ITR-PhCMV-KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR, pJH1054), NRF2 (ITR-PhCMV -NRF2-pA:PRPBSA-ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR, pJH1101) y expresión de insulina dependiente de NRF2 (ITR-PDART4-SEAP-P2A-mINS-pA:PmPGK-ZeoR-pA-ITR, pJH1169, PDART4 , OARE4-PhCMVmin) (Datos ampliados, Fig. 6a). Para maximizar el rango dinámico de expresión de insulina, utilizamos la variante del promotor sintético PDART4, que contiene cuatro sitios operadores ARE en tándem (Fig. 1f). Se perfilaron varias líneas celulares monoclonales para la expresión de insulina controlada por DC y el mejor clon de células hMSC-TERT DCINS (Datos ampliados, Fig. 6b, c), que mostró una mejor inducción y liberación de insulina electroestimulada en comparación con células isogénicas transfectadas transitoriamente. Las poblaciones (Datos ampliados, Fig. 6c) fueron seleccionadas para el tratamiento de la diabetes tipo 1 experimental. Confirmamos mediante qPCR y transferencia Western que la línea celular DCINS tenía niveles aumentados de transcripciones y proteínas KEAP1 y NRF2 en comparación con la línea celular parental (Datos ampliados, figuras 6d-g). La estimulación de células DCINS con 4,5 V CC de tres baterías AA para tiempos de exposición entre 5 s y 25 s pudo regular con precisión los niveles de expresión de SEAP (Fig. 4a) e insulina (Fig. 4b) y se mantuvieron distintos perfiles de inducción durante períodos de tiempo más largos. (Figura 4c). El examen de la cinética de inducción reveló que la producción de proteína electroestimulada alcanzó un nivel significativo en el sobrenadante del cultivo en 3 h (Fig. 4d), que es más rápido que en el caso de las células transfectadas transitoriamente (Fig. 2d). Además, las células DCINS exhibieron una excelente reversibilidad de la expresión de SEAP (Fig. 4e) y de insulina (Fig. 4f) en respuesta a patrones de estimulación ON-OFF-ON o OFF-ON-OFF a intervalos de 24 h.

Niveles de a, b, SEAP (a) e insulina (b) en sobrenadantes de cultivo de células DCINS monoclonales que contienen de manera estable el sistema DART 24 h después de la estimulación eléctrica. El voltaje para estimular las células fue proporcionado por tres baterías AA (4,5 V DC) durante los periodos de tiempo indicados. c, Cinética de producción de SEAP durante 72 h después de la exposición de las células DCINS a 4,5 V CC durante los períodos de tiempo indicados. Los factores de inducción se calcularon entre el grupo estimulado y no estimulado a los 25 s. d, SEAP producida durante las primeras 2, 3 y 6 h por células DCINS no estimuladas o estimuladas con 4,5 V DC durante 20 s. Los factores de inducción se calcularon entre los grupos indicados. e, f, Reversibilidad de las células DCINS que expresan SEAP (e) e insulina (f). Las células DCINS se cultivaron alternativamente durante ciclos de 24 h en medio tratado con 5 V CC durante 20 s (ON) o sin electroestimulación (OFF). Se recogieron muestras de sobrenadante de cultivo cada 12 h para analizar SEAP y producción de insulina. Se intercambió el medio de cultivo y se reajustó la densidad celular cada 24 h. Todos los datos son medias ± sd; n = 4. El valor de P indica la importancia de las diferencias en los valores medios; grupo indicado versus el grupo no estimulado (a,b,d). Las designaciones estadísticas con diferentes colores se refieren a los puntos de datos correspondientes con el mismo color (c).

Datos fuente

Como la expresión de insulina controlada por DART electroestimulada por CC no requiere ningún sistema electrónico de control complejo, utilizamos un paquete de baterías AA triple que proporciona 4,5 V CC, conectado mediante un simple interruptor de encendido/apagado manual a dos agujas de acupuntura platinizadas personalizadas (Figura complementaria 9a). –i y Tabla complementaria 6) ubicadas a 6 mm de distancia en el sitio de implantación para estimular DCINS implantado por vía subcutánea en la parte posterior de ratones diabéticos tipo 1 (Fig. 5a, b). Antes de la implantación, confirmamos que las células DCINS microencapsuladas en alginato semipermeable clínicamente autorizado mostraban una liberación precisa de insulina dependiente del tiempo cuando se estimulaban con 4,5 V CC (Figura complementaria 9j). Para confirmar que la insulina se produce y secreta en respuesta a la electroestimulación directa de las células implantadas, utilizamos un grupo de control negativo con implantación dorsal similar, pero estimulado con agujas de acupuntura colocadas a 3 cm del sitio del implante. En el grupo tratado, una única electroestimulación de 4,5 V durante 10 s por día atenuó la glucemia en ayunas en 2 días y la normoglucemia se restableció durante todo el período de tratamiento de 4 semanas (Fig. 5c). De acuerdo con estos resultados, los niveles de hemoglobina glucosilada (HbA1c) se atenuaron en ratones DT1 electroestimulados durante 5 semanas de tratamiento, alcanzando niveles similares a los de los ratones de tipo salvaje (Datos ampliados, figura 7a). Por el contrario, cuando se estimularon ratones con diabetes tipo 1 con dos parches adhesivos conductores de electricidad adheridos al sitio de implantación en lugar de agujas de acupuntura platinizadas, los animales permanecieron tan hiperglucémicos como los ratones con diabetes tipo 1 no estimulados, lo que indica que este método de estimulación no puede desencadenar la producción de insulina a partir de células DCINS implantadas. (Datos ampliados Fig. 7b,c). También evaluamos cómo respondieron los ratones a la estimulación con agujas de acupuntura cuando fueron tratados previamente con NAC (eliminador de ROS) o inhibidores de las enzimas generadoras de ROS. De acuerdo con los resultados in vitro, solo la NAC anuló el efecto de la electroestimulación, y los ratones mostraron niveles de glucosa e insulina en sangre similares a los de los ratones no estimulados (Datos ampliados, Fig. 7d, e). La evaluación macroscópica del sitio de implantación 4 semanas después del trasplante no mostró diferencias obvias entre ratones estimulados y no estimulados o en comparación con ratones de tipo salvaje no trasplantados (Figuras complementarias 10a-c). Para confirmar que la estimulación no tiene impacto en los tejidos circundantes, analizamos los tejidos adyacentes al sitio del electrodo de ratones estimulados y no estimulados de acuerdo con la norma ISO 10993-6 (ref. 46). No observamos citotoxicidad relacionada con el material o la electroestimulación ni ninguna respuesta inmune local notable alrededor del sitio de implantación (Figura complementaria 10d-g y Tabla complementaria 7). No hubo diferencias histopatológicas aparentes entre los grupos que contienen electrodos no estimulados y los que contienen electrodos estimulados eléctricamente (Figura complementaria 10d-g y Tabla complementaria 7). El perfil de mediadores inflamatorios en el suero de los grupos no estimulados y electroestimulados tampoco mostró diferencias significativas (Datos ampliados, figuras 8a a c). Además, la electroestimulación breve no tuvo ningún efecto aparente sobre el pH de la sangre (Datos ampliados, figura 8d). Las pruebas de tolerancia a la glucosa (GTT) revelaron que la producción y liberación de insulina electroestimulada no solo restauró la homeostasis de la glucosa, sino que también atenuó la excursión glucémica posprandial en comparación con los grupos de control negativo sin ningún implante, o con implantes no estimulados, o con implantes pero electroestimulación a distancia (Fig. 5d y datos ampliados Fig. 8e). El control glucémico fue completamente reversible cuando el estado de electroestimulación se cambió de APAGADO a ENCENDIDO o de ENCENDIDO a APAGADO en intervalos de 3 días (Fig. 5e). Los animales electroestimulados tenían niveles de insulina en sangre significativamente más altos que los grupos de control, lo que confirma que la inducción de la producción y secreción de insulina impulsada por CC restableció la homeostasis de la glucosa en ratones diabéticos tipo 1 (Fig. 5f). Además, perfilamos los niveles de glucosa en sangre varias veces al día, durante 24 h después de la electroestimulación con CC 4,5 V durante 10 s y no observamos ningún episodio de hipo o hiperglucemia (Fig. 5g). De acuerdo con este hallazgo, el análisis temporal de otros biomarcadores de deficiencia de insulina, a saber, insulina, cetonas, triglicéridos y glucagón, no reveló diferencias significativas entre los ratones con diabetes tipo 1 electroestimulados y los animales de tipo salvaje, mientras que esos biomarcadores fueron significativamente más bajos (insulina). y superiores (cetonas, triglicéridos y glucagón) en ratones con diabetes tipo 1 no estimulados, respectivamente (Datos ampliados, figura 9).

a, Esquema que muestra cómo se estimulan las células encapsuladas diseñadas con DART implantadas en la espalda de ratones. b, Imagen que muestra las agujas de acupuntura personalizadas conectadas a las baterías alcalinas. c, Se registró la glucemia en ayunas antes de la implantación (día 0) y durante cuatro semanas consecutivas después de la implantación en tres grupos de ratones con diabetes tipo 1 con implantes de células DCINS, a saber, ratones no estimulados, ratones estimulados durante 10 s en el sitio de implantación (estimulados) y ratones con implantes celulares estimulados durante 10 s con electrodos colocados en la espalda a 3 cm del sitio del implante (estimulados a distancia). También se utilizaron como controles ratones de tipo salvaje y ratones con diabetes Tipo 1 sin implantes. d, Se realizó GTT intraperitoneal en ratones 3 días después de la implantación de células microencapsuladas y después de un ayuno de 8 h. e, Reversibilidad del control glucémico mediado por DART. Las células microencapsuladas se electroestimularon percutáneamente en el sitio de implantación mientras se invertía la estimulación ON-OFF/OFF-ON cada tres días, utilizando 4,5 V CC durante 10 s como ON. f, Se perfilaron los niveles de insulina en sangre de animales no estimulados y electroestimulados 1, 2, 3 y 4 semanas después de la implantación. Los grupos estimulados y estimulados a distancia (a 3 cm del sitio del implante) fueron tratados con 4,5 V CC durante 10 s por día (c,f). g, excursiones de glucosa en sangre el día 4 después de la implantación. Se recolectaron muestras de sangre en varios puntos temporales para el análisis de glucosa en ratones de tipo salvaje y ratones con diabetes tipo 1 no estimulados y estimulados con CC 4,5 V durante 10 s. La hora cero correspondió a la medianoche y la electroestimulación se realizó a las 6:00 horas. Todos los datos son medias ± DE; norte = 5; los valores se normalizaron para el grupo de tipo salvaje. El experimento se realizó una vez en g. Los valores de P indican la importancia de las diferencias en los valores medios; grupo estimulado versus grupo no estimulado (azul) o grupo de tipo salvaje (negro) (c,d); grupo estimulado versus grupo no estimulado (g); dos grupos entre sí (e); y grupo estimulado versus grupo indicado (f).

Datos fuente

Para evaluar la capacidad de ajuste del sistema DART in vivo, estimulamos ratones con diabetes tipo 1 durante diferentes períodos de tiempo (entre 5 y 15 s) utilizando de dos a cinco baterías AA y una batería de bloque de 9 V como fuentes de energía, proporcionando 3, 4,5, 6, 7,5 y 9 V de CC, respectivamente. Observamos la capacidad de ajuste de la glucosa en sangre (Fig. 6a, b) y la insulina en sangre (Fig. 6c, d) dependiente del voltaje y del tiempo, así como un ajuste fino concomitante de otros biomarcadores de deficiencia de insulina, cetonas, triglicéridos y glucagón. (Datos ampliados Fig. 10a-f), que muestra que la homeostasis metabólica podría restaurarse aplicando electroestimulación de 4,5 V durante 10 s o más (Fig. 6b, d) y confirmando la sintonizabilidad in vitro de las células transgénicas DART (Fig. 2b, cy 4a-c, figuras de datos ampliadas 3g, h y 7j y figura complementaria 5c).

a – d, niveles de glucosa en sangre (a, b) e insulina (c, d) de ratones con diabetes tipo 1 con implantes de células DCINS electroestimulados con diferentes voltajes (3, 4,5, 6, 7,5 y 9 V) durante 5 s (a, c) y por diferentes periodos de tiempo (0, 5, 10 y 15 s) a 4,5 V (b,d). Los voltajes se aplicaron con dos a cinco baterías AA y una batería de bloque de 9 V, respectivamente. Como controles se utilizaron ratones con diabetes tipo 1 y de tipo salvaje sin ningún tratamiento. Las muestras de sangre se tomaron después de 6 h de ayuno. Los perfiles sanguíneos correspondientes de los biomarcadores de deficiencia de insulina, cetonas, triglicéridos y glucagón se muestran en las figuras de datos ampliados. 10a-f, Monitoreo de series temporales de glucosa en sangre (e) e insulina (f) el día 4 después de la implantación en ratones con diabetes tipo 1 sin diabetes. estimulado o estimulado una, dos, tres o cuatro veces por día con CC 4,5 V durante 10 s según el esquema de Datos ampliados Fig. 10g. Los perfiles sanguíneos correspondientes de los biomarcadores de deficiencia de insulina, cetonas, triglicéridos y glucagón se muestran en las figuras de datos ampliados 10h-j. Todos los datos son medias ± DE; norte = 5; el experimento se realizó una vez y los valores se normalizaron para el grupo de tipo salvaje. El valor de P indica la importancia de las diferencias en los valores medios. Las designaciones estadísticas con diferentes colores se refieren a los puntos de datos correspondientes con el mismo color (e,f).

Datos fuente

Finalmente, evaluamos cómo responde el sistema DART implantado a hasta cuatro electroestimulaciones por día, para imitar la necesidad de múltiples inyecciones diarias de insulina en algunos pacientes con diabetes Tipo 1. Para imitar el patrón en humanos, programamos ciclos repetidos de ayuno y alimentación para los ratones a lo largo del día (Datos ampliados, figura 10g). En todos los grupos electroestimulados, los niveles de glucosa e insulina fluctuaron alrededor de los niveles de tipo salvaje y todos mostraron diferencias significativas con respecto al grupo no estimulado en cada momento (Fig. 6e, f). Para realizar una evaluación integral del estado diabético de todos los grupos, tomamos muestras de sangre cada 3 h durante el día y analizamos los cuerpos cetónicos, los triglicéridos y el glucagón. Los resultados indicaron que todos los programas de electroestimulación, de uno a cuatro por día, mejoraron significativamente el estado glucémico de los ratones diabéticos (Datos ampliados, figuras 10h-j).

DART proporciona una interfaz electrogenética reversible y sintonizable operada por fuentes de CC de bajo voltaje simples y fácilmente disponibles, como baterías que se usan ampliamente para alimentar dispositivos electrónicos portátiles o portátiles18,47. En particular, DART requiere muy poca potencia y energía general para controlar la expresión del gen objetivo. Como una única estimulación eléctrica utilizando dos electrodos separados por 6 mm durante sólo 10 s es suficiente para desencadenar la producción y liberación de suficiente insulina diaria, estimamos que la potencia eléctrica de CC necesaria para una inyección diaria de insulina es de alrededor de 0,06 W, lo que permitiría una simple estimulación. Paquete de baterías triple AA de 4,5 V para funcionar durante más de 5 años, proporcionando una dosis terapéutica diaria. En principio, los tiempos de funcionamiento podrían optimizarse aún más disminuyendo la resistencia reduciendo la separación de los electrodos o, como hemos demostrado, utilizando paquetes de baterías de mayor voltaje y mayor capacidad para lograr tiempos de inducción aún más cortos. Además, el control de DART requiere sólo un simple interruptor eléctrico manual de ENCENDIDO/APAGADO. Además, como DART puede estimular directamente células diseñadas que están microencapsuladas en microcontenedores de alginato aprobados por la FDA de EE. UU. que están clínicamente autorizados y validados para el trasplante de islotes humanos48 mediante agujas de acupuntura aprobadas por la OMS y la FDA de EE. UU.49, el control remoto es simple y no requiere el uso de implantes bioelectrónicos complejos y propensos a fallas, que son particularmente difíciles de operar en un entorno de tejido32. De hecho, nuestro primer dispositivo de implante de células electrogenéticas se basó en la sensibilización de las células a campos eléctricos mediante la coexpresión de dos canales iónicos vinculados a cascadas de señalización endógenas y la encapsulación de las células en un complejo implante bioelectrónico inalámbrico, activado por CA a alto voltaje con tiempos de estimulación extendidos32. Por el contrario, la tecnología DART aprovecha los sensores ROS intracelulares que sensibilizan las células encapsuladas en alginato para dirigir la estimulación CC de bajo voltaje alimentada por baterías en segundos a través de dos simples agujas de acupuntura y sin la necesidad de usar o implantar ningún dispositivo electrónico. De hecho, la electroestimulación mediante agujas de acupuntura ya es una práctica estándar en la medicina tradicional china para el tratamiento de la inflamación, el dolor crónico, los espasmos musculares y los trastornos neurológicos50,51, representando una modalidad terapéutica aprobada por la OMS49 y practicada a nivel mundial. Como el sistema DART no necesita horas a voltajes más altos, sino solo segundos a voltajes más bajos para activar la expresión transgénica, tiene mayor eficiencia energética y seguridad. Por lo tanto, creemos que el control rápido, sin electrónica, de CC de bajo voltaje y alimentación directa de transgenes terapéuticos en células humanas es un salto adelante, que representa el eslabón perdido que permitirá que los dispositivos portátiles controlen genes en un futuro no muy lejano.

En el lado molecular de la interfaz electrogenética, DART aprovecha la omnipresente detección de ROS mediada por KEAP1/NRF2. La producción de ROS es parte del proceso respiratorio celular34,52, pero encontramos que los niveles intrínsecos de producción de ROS y el sistema de gestión de ROS mediado por KEAP1/NRF2 no interfieren con DART y no inducen sustancialmente promotores específicos de DART. En cambio, las células humanas deben estar sensibilizadas a la producción de ROS electroinducible mediante la expresión ectópica de KEAP1 y NRF2 nativos, que desvían la detección de ROS a promotores PDART sintéticos que impulsan la producción biofarmacéutica. Al igual que con otras modalidades sintéticas de control de la transcripción, no se puede descartar por completo la activación de genes endógenos7; sin embargo, el análisis comparativo de secuenciación profunda sugirió que tal efecto es mínimo. Además, el análisis espectroscópico de masas del medio de cultivo no mostró diferencias sustanciales entre los cultivos celulares no estimulados y electroestimulados, lo que indica que la activación de DART no causa suficiente electrólisis en el medio de cultivo para perturbar los sistemas celulares. Además, DART se compone exclusivamente de componentes endógenos, que implican la expresión ectópica simple de los factores endógenos nativos KEAP1 y NRF1 y promotores objetivo ensamblados fusionando elementos ARE nativos en tándem a una caja promotora mínima, lo que debería minimizar los riesgos que pueden asociarse con la ingeniería celular, como como transformación neoplásica.

Cualitativamente, la producción de ROS electroestimulada se desencadena mediante la creación de iones de cloro y cloro gaseoso potencialmente peligrosos, así como protones e hidrógeno gaseoso en el ánodo y el cátodo, respectivamente; sin embargo, encontramos que la electroestimulación no tuvo ningún impacto negativo ni en la viabilidad ni en el transcriptoma de las células ni en la composición del medio, presumiblemente debido al bajo voltaje y los cortos tiempos de inducción de solo unos pocos segundos. De hecho, una sola electroestimulación diaria de células diseñadas implantadas a 4,5 V durante 10 s desencadenó la producción y liberación de suficiente insulina para restaurar la normoglucemia en la diabetes tipo 1 experimental, mostrando una eficacia comparable a las terapias con insulina de acción prolongada que pueden mantener niveles de azúcar en sangre bastante estables durante 24 segundos. h18,22,32. El control DART también proporcionó suficiente insulina para atenuar rápidamente la excursión glucémica posprandial, como lo demuestran los GTT. Además, el control DART era reversible y también ajustable con precisión variando el voltaje y/o el período de electroinducción. En particular, también evaluamos varios biomarcadores de deficiencia de insulina en animales tratados con el sistema DART utilizando diferentes baterías, diferentes períodos de inducción y diferentes frecuencias. Las mejoras de los niveles de glucosa e insulina confirman que DART es un sistema eficiente. Además, la mejora de los niveles de cetonas en ratones diabéticos también reduciría el riesgo de cetoacidosis diabética.

Si bien elegimos la producción de insulina controlada por DART para la validación de la prueba de concepto, debería ser sencillo vincular el control de DART con la producción y dosificación in situ de una amplia gama de productos biofarmacéuticos. Creemos que las interfaces electrogenéticas simples como DART, que interconectan funcionalmente sistemas biológicos analógicos con dispositivos electrónicos digitales, son muy prometedoras para una variedad de terapias futuras basadas en genes y células, incluidas intervenciones genéticas de circuito cerrado, dosificación en tiempo real y monitoreo telemétrico global mediante personal médico o algoritmos.

Los detalles de construcción para todos los vectores se proporcionan en la Tabla complementaria 1. Los plásmidos clave incluyeron (1) un vector de expresión constitutivo de KEAP1 (pJH1004, PhCMV-KEAP1-pA) y el vector correspondiente que contiene repeticiones terminales invertidas (ITR) de la transposasa de la Bella Durmiente (SB). (pJH1054, ITR-PhCMV-KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR) para la generación de líneas celulares estables; (2) un vector de expresión constitutivo de NRF2 (pJH1003, PhCMV-NRF2-pA y pJH1101, ITR-PhCMV-NRF2-pA: PRPBSA-ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR); y (3) promotores sintéticos dependientes de NRF2 que contienen sitios operadores ARE fusionados a un promotor mínimo (pJH1005, PDART-SEAP-pA y pJH1169, ITR-PDART4-SEAP-P2A-mINS:PmPGK-ZeoR-pA-ITR).

Células de riñón embrionario humano (HEK293, ATCC, CRL-11268), células de fibrosarcoma humano (HT-1080, ATCC, CCL-121), células de adenocarcinoma cervical humano (HeLa, ATCC, CCL-2), células madre mesenquimales inmortalizadas con telomerasa humana (hMSC-TERT53, RRID:CVCL_Z015), línea celular de cáncer de hígado humano (Hep G2, ATCC, CRL-11997), línea celular de adenocarcinoma colorrectal humano (Caco-2, ATCC, HTB-37), línea celular de mioblastos de ratón (C2C12, ATCC, CRL-1772), células de riñón de hámster bebé (BHK-21, ATCC, CCL-10) y células de ovario de hámster chino (CHO-K1, ATCC, CCL-61) se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, cat. n.° 52100-39, Thermo Fisher Scientific) suplementado con prolina 100 mM (solo CHO-K1), suero bovino fetal al 10 % (FBS, n.° de cat. F7524, n.° de lote 022M3395, Sigma-Aldrich) y 1 % (v /v) estreptomicina/penicilina (n.º de cat. L0022, Biowest) y se cultivaron a 37 °C en una atmósfera humidificada que contenía 5 % de CO2. Para la transfección, se sembraron 50.000 células (CellDrop BF Brightfield Cell Counter, DeNovix) por pocillo en una placa de 24 pocillos (n.º de catálogo 3524, Corning Life Sciences), se cultivaron durante 12 h y se transfectaron mediante la adición de 50 µl de una mezcla. que contenía 1,6 µg de polietilenimina (PEI MAX, PM 40 000, 1 µg µl−1 en ddH2O, n.º de catálogo 24765-2, Polysciences) y 0,5 µg de ADN plasmídico (concentraciones equimolares para mezclas de plásmidos). Después de 8 h, la mezcla se reemplazó con medio de cultivo estándar (700 µl).

Se cotransfectaron un total de 1,5 x 105 células HEK293 o hMSC-TERT con pJH1101 (200 ng), pJH1054 (550 ng), pJH1169 (400 ng) y pJH42 (PhCMV-SB100X-pA) que codifican la expresión constitutiva de un SB hiperactivo. transposasa54 (200 ng). Después de la expansión clonal, las líneas celulares monoclonales se examinaron mediante electroestimulación y se seleccionó la mejor línea celular DCINS para estudios in vitro y en animales.

Las 2,5 x 106 células HEK293 se sembraron en una placa de 10 cm de diámetro (Greiner Bio-one, nº de catálogo 664160) durante 24 h antes de la transfección con 30 μg de pJH3 (PhCMV-SEAP-pA). Al día siguiente, las células se resuspendieron y se volvieron a sembrar uniformemente en dos placas de 24 pocillos. Los grupos de tratamiento fueron estimulados a 5 V CC durante diferentes períodos de tiempo. Se recolectaron muestras en puntos de tiempo sucesivos durante 48 h para cuantificar el recuento de células viables y la producción de SEAP.

Los compuestos moduladores de ROS se proporcionaron 30 minutos antes de realizar la electroestimulación para experimentos tanto in vitro como in vivo, en las concentraciones indicadas en las leyendas de las figuras. Todos los compuestos utilizados fueron de Sigma-Aldrich, a saber, NAC40 (n.º de cat. A7250-50G), GKT136901 (n.º de cat. 5340320001), AEBSF (n.º de cat. SBR00015-1ML), ML171 (n.º de cat. 492002-10MG ) y VAS2870 (n.º de catálogo SML0273-25MG)41.

Las células se incubaron durante 2 h con resazurina (50 μg ml-1, n.º de catálogo R7017, Sigma-Aldrich) antes de registrar la fluorescencia a 540/590 nm (lector de placas Tecan Infinite 200 PRO, Tecan Group AG)32.

Los niveles de SEAP se perfilaron en sobrenadantes de cultivos celulares mediante un ensayo colorimétrico. Se mezcló un total de 100 µl de tampón de ensayo SEAP 2X (homoarginina 20 mM, MgCl2 1 mM y dietanolamina al 21 %, pH 9,8) con 80 µl de sobrenadante de cultivo inactivado por calor (30 min a 65 °C). Después de la adición de 20 µl de sustrato (fosfato de p-nitrofenilo 120 mM; n.º de catálogo AC128860100, Thermo Fisher Scientific), se registró la absorbancia durante 30 minutos a 405 nm y 37 °C (Tecan Infinite 200 PRO) y se determinaron los niveles de SEAP. determinado como se describió anteriormente55.

Las células electroestimuladas o inducidas químicamente se lavaron con 300 µl de solución salina tamponada con fosfato (PBS, n.º de catálogo 14190-094, Thermo Fisher Scientific), se incubaron durante 45 minutos en 500 µl de DMEM sin FBS que contenía 25 µmol l-1 2'. diacetato de 7′-diclorofluoresceína (n.º de catálogo D6883, Sigma-Aldrich) y se lavaron nuevamente con 300 µl de PBS y luego se cuantificaron los niveles de ROS mediante ensayo de fluorescencia56 (485/535 nm, Tecan Infinite 200 PRO).

La insulina se cuantificó mediante un kit ELISA (n.º de catálogo 10-1247-01, Mercordia).

La glucosa en sangre se cuantificó utilizando las tiras reactivas ContourNext con licencia clínica y el lector ContourNext ONE (Ascensia Diabetes Care)57.

Los sobrenadantes de cultivo de células transgénicas DART electroestimuladas a 10 V CC durante 30 s se analizaron directamente mediante espectrometría de masas de ionización por electropulverización utilizando cultivos de células isogénicas no estimuladas como controles negativos. Las muestras se inyectaron directamente a 0,3 ml min-1 con un dispositivo de cromatografía líquida de alto rendimiento (UltiMate 3000, Thermo Fisher Scientific) y los espectros de espectrometría de masas de ionización por electropulverización se registraron en modos de polaridad de iones positivo y negativo utilizando un maXis 4 G de alta densidad. espectrómetro de masas de resolución (Bruker) equipado con una fuente de ionización por electropulverización ajustada a una temperatura capilar de 200 °C y un voltaje de pulverización de 4,5 kV.

Los niveles de interferón (IFN)-γ de ratón, interleucina (IL)-6 y factor de necrosis tumoral (TNF)-α se cuantificaron utilizando IFN-γ (n.º de catálogo BMS606-2), IL-6 (n.º de catálogo BMS603HS). y kits de ELISA de ratón TNF-α (n.º de catálogo BMS607HS) (todos de Thermo Fisher), respectivamente.

El cloro gaseoso disuelto en el medio de cultivo se analizó utilizando tiras reactivas (DPD-1, nº de catálogo 486637), que se cuantificaron mediante un fotómetro (eXact EZ Photometer, nº de catálogo 486205) (todos de ITS Europe).

El pH del medio se midió utilizando papel de prueba de pH de alta precisión (cat. no. D-52348, MACHEREY-NAGEL) y el pH de la sangre se midió con un fotómetro (eXact EZ Photometer, cat. no. 486205, ITS Europe) con tiras de pH ( nº de catálogo 486639, ITS Europa).

Las células en crecimiento exponencial se lisaron en tampón RIPA enfriado con hielo (NaCl 150 mM, Tris-HCl 8,0 50 mM, Nodidet P-40 (NP40) al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, ortovanadato de sodio 1 mM, NaF 1 mM. e inhibidores de proteasa; Roche), durante 30 min a 4 °C con agitación continua, seguido de centrifugado a 15,000 g durante 20 min a 4 °C. Los sobrenadantes se transfirieron a tubos nuevos en hielo. La concentración de proteína total se cuantificó con un kit de ensayo de proteínas Pierce BCA (n.º de catálogo 23225, Thermo Fisher). Luego, las muestras se hirvieron en tampón Laemmli 2X a 95 °C durante 5 minutos. Luego, se resolvieron 20 μg de muestra mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (n.º de catálogo 88518, Thermo Fisher) en tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina 190 mM y metanol al 20%). Después de la transferencia, las membranas se bloquearon con leche desnatada al 5 % durante 1 hora a temperatura ambiente y se incubaron con KEAP1 (n.º de cat. ab227828, Abcam; dilución 1:5000) y NRF2 (n.º de cat. ab137550, Abcam, dilución 1:5000). ) anticuerpos primarios durante la noche a 4 °C, seguido de incubación con anticuerpo secundario (anticuerpo entero unido a HRP anti-IgG de conejo, n.º de cat. GENA934-1ML, Sigma-Aldrich, dilución 1:10 000). Las transferencias se visualizaron después de agregar el sustrato quimioluminiscente (Pierce ECL Western Blotting Substrate, cat. no. 32106, Thermo Fisher) con un sistema de detección de quimioluminiscencia (FusionPulse TS, cat. no. 121172301, v.5.12a). Se utilizaron como control anti-β-actina de ratón (Sigma, n.º de cat. A2228, dilución 1:5.000) e IgG anti-ratón de oveja (Sigma, n.º de cat. GENA931V, dilución 1:10.000).

Las muestras de ARN mensajero de células cultivadas se extrajeron utilizando un kit Quick-RNA Miniprep (Zymo Research, nº de catálogo R1054) y se cuantificaron con un NanoDrop 2000 (Thermo Fisher). La biblioteca de ADN complementaria se construyó utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems, nº de catálogo 4368814). El análisis qPCR utilizando SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad, nº de catálogo 1725271) se realizó mediante QuantStudio 3 (Thermo Fisher). Los cebadores utilizados para KEAP1, NRF2 y los genes de mantenimiento se enumeran en la Tabla complementaria 8.

Los niveles séricos de HbA1c se cuantificaron utilizando un kit de ensayo de HbA1c en ratón (n.º de catálogo 80310, CrystalChemA).

Los niveles séricos se cuantificaron utilizando kits de ensayo ELISA de cuerpos cetónicos (n.º de cat. MAK134-1KT, Sigma-Aldrich), triglicéridos (ab65336, Abcam) y glucagón (n.º de cat. 10-1271-01, Mercodia), respectivamente.

Se sembraron células HEK293 durante la noche, se electroestimularon a 5 V CC durante 10 o 25 segundos y 8 h después se recogieron para la extracción de ARN total utilizando un kit Quick-RNA Miniprep (Zymo Research, nº de catálogo R1054). La calidad del ARN se analizó mediante un BioAnalyzer (Agilent Technologies). Las bibliotecas se prepararon con el PrepKit de biblioteca de ARN total monocatenario Illumina Truseq (Illumina). Cada biblioteca se secuenció utilizando un sistema HiSeq 2500 (Illumina), lo que dio como resultado aproximadamente 30 millones de lecturas de 81 unidades de extremo único ubicadas cerca del extremo 3' del ARNm por muestra.

Los datos de secuenciación se demultiplexaron y se analizaron principalmente utilizando un flujo de trabajo Snakemake58, que consiste en Trimmomatic (v.0.35), alineación con el genoma GRCh38 con HISAT2 (v.2.1.0), SAMtools (v.1.9) para ordenar e indexar los archivos BAM de alineación. y featureCounts del paquete Subread (v.2.0.1) para contar lecturas en los rangos de genes, utilizando la anotación Ensembl humana v.105. Los vectores de recuento de todas las muestras se combinaron en una tabla, que luego se sometió al análisis secundario en R. El control de calidad y la consistencia de la muestra se verificaron con un análisis de componentes principales utilizando el paquete PCATools de R. La tabla de recuento se procesó en el análisis secundario (estadístico) con scripts R utilizando edgeR (v.3.32)59, en particular, un modelo log-lineal generalizado binomial con pruebas de contraste. Resultó en listas de genes clasificados según su expresión diferencial por valor de P y utilizó un valor de P ajustado por Benjamini-Hochberg como estimación de la tasa de descubrimiento falso.

El recubrimiento de poli(3,4-etilendioxitiofeno)poliestireno sulfonato (PEDOT:PSS) se realizó mediante deposición anódica60 utilizando una estación de trabajo electroquímica (CHI760E, número de serie E1174, v.20.4.0.0). El proceso se realizó en 40 ml de solución acuosa (KCl 0,1 M y 5 ml de solución PEDOT:PSS (1% p/p en dimetilsulfóxido)) a 3,0 V CC. Para la electrodeposición se utilizó una solución acuosa que contenía H2PtCl6 5 mM, urea 1 mM y H2SO4 0,1 M. Se utilizaron agujas de acupuntura recubiertas con PEDOT:PSS (PEDOT:PSS/SS) como contador y electrodos de trabajo, respectivamente. La electrodeposición de CC se realizó utilizando un potenciostato (CHI760E) configurado para una densidad de corriente optimizada de −20 mA cm−2 durante 10 min61. Después de la electrodeposición, los electrodos de Pt-PEDOT:PSS/SS se lavaron con agua Millipore y se secaron a 90 °C durante 6 h. La morfología de las sondas se observó bajo un microscopio electrónico de barrido (FEI Sirion 400 NC) a un voltaje de aceleración de 5,0 kV. Se utilizó un analizador electroquímico CHI760E controlado por el software CHI para registrar la corriente electroquímica.

Se conectaron tres baterías AA en tándem (nombre IEC LR06; Energizer, n.º de catálogo E300173103) a un probador de baterías con un potenciostato (CHI760E). La descarga galvanostática se midió mediante el método de cronopotenciometría con la corriente anódica indicada.

En las figuras se muestran la presentación de los datos, el tamaño de la muestra de las réplicas biológicas (n), el análisis estadístico y la importancia de las diferencias. Todos los experimentos in vitro se reprodujeron al menos dos veces, a menos que se indique lo contrario. Para los experimentos con ratones, se utilizaron réplicas biológicas (n = 5 ratones), a menos que se indique lo contrario. Los detalles se describen en la leyenda de cada figura. Para determinar la significación estadística de las diferencias en el caso de comparaciones múltiples utilizamos GraphPad Prism 8 (v.9.2.0, GraphPad Software) o Microsoft Excel (v.16.51, Microsoft) y una prueba t de Student de dos colas y no pareada. y análisis de varianza unidireccional.

El vídeo complementario 1 se filmó en una incubadora a 37 °C y 5 % de CO2 utilizando un teléfono móvil Huawei P30. Los vídeos complementarios 2 y 3 se grabaron en un sistema microscópico Zeiss LSM 980 Airyscan. Las películas fueron procesadas adicionalmente por el software Shotcut (v.21.09.20) y HandBrake (v.1.4.2).

Para la electroestimulación in vitro cultivamos células electrosensibles en placas estándar de 24 pocillos con 700 µl de medio de cultivo, que permiten la inmersión de dos electrodos de platino con una separación de 6 mm fijados en una tapa personalizada. La tapa de una placa de 24 pocillos (n.º de cat. 3524, Corning Life Sciences) se pegó con placas (n.º de cat. H25PR500, Reichelt Elektronik) y alambres de platino (n.º de cat. HXA 050, Cooksongold; figura complementaria 1a ,b). La energía eléctrica se aplicó con los parámetros y períodos indicados utilizando una fuente de alimentación CC (KD3005P, KORAD) o varios paquetes de baterías. Los pulsos de CA cuadrados se generaron mediante un generador de funciones de fuente universal HP3245A (n.º de cat. 3245A, Hewlett Packard) conectado a un amplificador lineal P200 (n.º de cat. P200, FLC Electronics). Los parámetros AC utilizados se indican en las leyendas de las figuras. Los voltajes y corrientes de CC y CA se confirmaron conectando un potenciostato CHI760E y un osciloscopio digital (n.º de catálogo DS1052E, Soochow). Para la electroestimulación in vivo de células microencapsuladas implantadas por vía subcutánea, utilizamos tres baterías AA (nombre IEC LR06; Energizer, n.º de cat. E300173103) como fuente de alimentación de CC y agujas de acupuntura estériles con punta platinada o electrodos de platino personalizados (n.º de cat. 1503030 , Wandrey) con una separación de 6 mm como electrodos. Luego, se inyectó 1 ml de medio DMEM nuevo en el sitio de implantación antes de la electroinducción.

Además de las pilas AA, también utilizamos pilas AAA (IEC-LR03, Energizer, n.° de cat. E303271700), bloques de 9 V (IEC-6LR61, Conrad, n.° de cat. CE-650900), pilas de botón (IEC-CR2032 , Energizer, n.º de cat. E303272400), baterías alcalinas de 12 V 23 A (IEC-8LR23, Energizer, n.º de cat. E301536201), baterías Exell A220/504 A (n.º de cat. 4331974451, Exell), un banco de energía Belkin (n.º de cat. 13350487) y cargadores de teléfonos móviles USB-C de Apple y Huawei para experimentos in vitro o in vivo.

Los electrodos se caracterizaron por voltamperometría cíclica. La calibración se realizó en una solución de hexacianoferrato (III) (K3Fe(CN)6) de potasio 10 mM. El experimento se realizó con un potenciostato CHI760E utilizando dos electrodos de platino como electrodos de trabajo y contraelectrodos y un electrodo de referencia Ag/AgCl (CHI111P, IJ Cambria Scientific). Se ejecutaron voltamogramas cíclicos entre −0,3 y 0,6 V para la calibración del electrodo y de −5 a 5 V para la medición a una velocidad de escaneo de 10 mV s−1. El sistema de tres electrodos se utilizó para la generación de ROS y la inducción de SEAP con células transitorias diseñadas por DART.

Para proteger las células DCINS humanas del sistema inmunológico del ratón y al mismo tiempo permitir la libre difusión de nutrientes y proteínas terapéuticas, utilizamos tecnología de encapsulación basada en alginato validada por ensayos clínicos y con licencia de la FDA de EE. UU.48. Las DCINS se microencapsularon en microcápsulas coherentes de alginato-poli(l-lisina)-alginato de 400 µm de diámetro mezclando 1,0 x 108 DCINS con 20 ml de alginato (p/v, 1,8%; alginato de Na, nº de catálogo 11061528, Buechi Labortechnik), 200 ml de solución de poli(l-lisina) 2000 (p/v, 0,05 %; n.º de cat. 25988-63-0, Alamanda Polymers) y utilizando un encapsulador (Inotech Encapsulator IE-50R, EncapBiosystems) ajustado a la siguientes parámetros: boquilla de 200 μm con frecuencia de vibración de 1.025 Hz, jeringa de 20 ml operada a un caudal de 400 unidades y voltaje de 1,12 kV para dispersión de perlas. Luego, se implantaron por vía subcutánea 1,5 ml de DMEM sin suero que contenía 7,5 x 106 células microencapsuladas (500 células por cápsula) a través de una jeringa de 3 ml (n.º de cat. 9400038, Becton Dickinson) equipada con una aguja de 0,7 x 30 mm (n.º de cat. .n° 30382903009009, Becton Dickinson).

Los ratones con diabetes tipo 1 se establecieron mediante el ayuno de ratones suizos machos de tipo salvaje de 6 semanas de edad (C57BL/6J, Janvier Labs) durante 8 h por día durante cuatro días consecutivos mientras se les inyectaba una dosis única por día de estreptozotocina recién diluida (cat. no. S0130, Sigma-Aldrich; 80 mg kg-1 en 300 μl de tampón citrato de sodio (pH 4,3)). La hiperglucemia en ayunas persistente asociada a la diabetes tipo 1 se confirmó después de 6 días mediante un perfil de glucemia en ayunas de 8 h. Para los GTT, a los animales tratados se les inyectó por vía intraperitoneal 1,5 g kg-1 de glucosa y se registró la glucemia a intervalos regulares. La insulina en sangre se cuantificó utilizando tubos separadores de suero Microtainer (n.º de catálogo 365967, Becton Dickinson). Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la legislación suiza sobre bienestar animal, aprobada por la oficina veterinaria del cantón de Basilea-Ciudad, Suiza (licencia n.º 2996/30779) y realizada por S. Xue (LTK4899) y J. Huang ( LTK5912) en el Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas de la ETH Zurich en Basilea y de acuerdo con las directivas del Consejo de la Comunidad Europea (2010/63/UE), aprobadas por la República Francesa (proyecto no. DR2018-40v5 y APAFIS no. 16753) y realizado por S. Xue, J. Huang y G. Charpin-El Hamnri (nº 69266309) en la Universidad de Lyon, Institut Universitaire de Technologie. Todos los ratones se alojaron en un ciclo de luz y oscuridad de 12 h (cinco ratones por jaula). La temperatura ambiente fue de 21 ± 1 °C con 50 ± 10% de humedad.

Se pegaron parches de doble adhesivo eléctricamente conductores (n.º de catálogo 9701-50, 3M Science) con cables como electrodos, que se fijaron al sitio de implantación para realizar la electroestimulación.

La primera electroestimulación se realizó 4 h después de inyectar las células microencapsuladas. Para un control regular de la glucosa durante varias semanas, los ratones fueron electroestimulados a medianoche con CC de 4,5 V durante 10 s, luego ayunaron durante 6 a 8 h para medir la glucemia o tomar muestras de sangre. Para controlar la glucosa durante un día entero en diferentes momentos, los ratones fueron electroestimulados a las 6:00. Para el experimento con ratones con múltiples electroestimulaciones por día, la primera se realizó a medianoche, seguida de estimulaciones adicionales a intervalos de 6 h.

Se tomaron muestras de sangre de la cola o de la vena safena utilizando un capilar de microhematocrito de vidrio de 200 µl (Avantor VWR, n.º de cat. 521-9100), se transfirieron a tubos de extracción de sangre (BD Microtainer, n.º de cat. BDAM365968) y se centrifugaron. a 8.000 g durante 2 min. El suero sobrenadante se analizó o se congeló a -80 °C dentro de la hora siguiente a la extracción de sangre.

A ratones C57BL/6J machos de 8 semanas de edad de tipo salvaje se les inyectaron células genéticamente modificadas encapsuladas. Todos los ratones estimulados y no estimulados que contenían dos electrodos se sacrificaron después de 30 minutos o 48 h de electroestimulación con CC 4,5 V durante 10 segundos y se almacenaron en una solución de formalina al 10% (n.º de catálogo HT501128-4L, Sigma-Aldrich).

Se retiraron las agujas de acupuntura y se explantó el tejido circundante y se fijó en formalina tamponada neutra al 10% (100 ml de formalina al 40%, 900 ml de ddH2O, 4 g l-1 de NaH2PO4 y 6,5 g l-1 de Na2HPO4, pH 7). Las muestras de tejido se recortaron, se deshidrataron en concentraciones crecientes de etanol, se aclararon con xileno, se infiltraron y se incluyeron en cera de parafina, se seccionaron con un espesor de 2 a 4 µm utilizando un sistema EXAKT 300 CP (EXAKT Technologies) y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las secciones de tejido se analizaron mediante microscopía óptica y las imágenes se adquirieron con una cámara Olympus UC30. Un patólogo de AnaPath Services evaluó histopatológicamente el tejido alrededor de la huella de la aguja de acupuntura de acuerdo con la norma ISO 10993-6:2016(E). Además, se calificó la desnaturalización del colágeno para excluir cualquier posible impacto termoeléctrico en los tejidos después de la electroestimulación.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los autores declaran que todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles en el artículo y sus materiales complementarios. Todos los plásmidos originales enumerados en la Tabla complementaria 1 están disponibles previa solicitud. Las secuencias pJH1003 (n.º de acceso a GenBank ON256650), pJH1004 (n.º de acceso a GenBank ON256651), pJH1005 (n.º de acceso a GenBank ON256652), pJH1054 (n.º de acceso a GenBank ON256653), pJH1101 (n.º de acceso a GenBank ON256654) y pJH 1169 (GenBank número de acceso ON256655) están disponibles en GenBank. Los datos originales se proporcionan con este documento.

El código utilizado en este documento está disponible públicamente en GitHub (https://github.com/Jinbo2022).

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Descargar referencias

Agradecemos a H. Zhao, M. Mansouri, S.-S. Cao y PG Ray por sus consejos generales, E. Loertscher y A. Wokaun por sus consejos sobre electroquímica y H. Zulewski por sus consejos sobre diabetología. También agradecemos a S. Mitteheisser y M. Pfeffer por su apoyo con la espectrometría de masas, a C. Beisel, I. Nissen-Naidanow y E. Vogel-Burcklen por su apoyo con la secuenciación de ARN, a M. Okoniewski por su apoyo con el análisis de secuenciación de ARN, a R Vetter y H.-M. Kaltenbach por su apoyo con el análisis estadístico, M. Viviani por su apoyo con microscopía de fluorescencia, G. Charpin-El Hamri por su apoyo con la experimentación con animales, H. Li por su apoyo con electroquímica y D. Maity por su apoyo con electrodos, electroquímica y pruebas de baterías. Este trabajo fue apoyado por una subvención avanzada del Consejo Europeo de Investigación (ElectroGene; subvención n.º 785800) y en parte por la Fundación Nacional Suiza de Ciencias NCCR Molecular Systems Engineering.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Federal Suizo de Tecnología de Zurich

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Biosistemas, ETH Zurich, Basilea, Suiza

Jinbo Huang, Shuai Xue, Peter Buchmann, Ana Palma Teixeira y Martín Fussenegger

Facultad de Ciencias, Universidad de Basilea, Basilea, Suiza

Martín Fussenegger

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JH, SX y MF diseñaron el proyecto. JH realizó los experimentos de cultivo celular. JH, SX, PB y APT diseñaron los dispositivos eléctricos. JH y SX realizaron experimentos electroquímicos y con animales. JH, SX, APT y MF diseñaron los experimentos y analizaron los resultados. JH, SX, APT y MF escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Martín Fussenegger.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Metabolism agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editora de manejo principal: Isabella Samuelson, en colaboración con el equipo de Nature Metabolism.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Análisis del curso temporal de ROS intracelular en células HEK-293 diseñadas con DART después de electroestimulación con 5 voltios CC durante 20 s. Los niveles de ROS se midieron en los momentos indicados. MFI: intensidad media de fluorescencia. b, c Efecto de los inhibidores de ROS en células HEK-293 diseñadas con DART. Producción de SEAP (b) y viabilidad celular (c) 24 horas después de la electroestimulación con CC de 5 voltios durante 20 s. Las células se incubaron con el eliminador de ROS N-acetil-L-cisteína (NAC, 2 mM), o inhibidores de las enzimas generadoras de ROS GKT136901 (0,2 μM), AEBSF (2 μM), ML171 (1 μM) y VAS2870 (2 μM) durante 30 min antes de realizar la electroestimulación. Cada barra representa la media ± DE de los cuatro puntos de datos indicados. Los valores de p se calcularon entre el grupo estimulado y el grupo no estimulado o indicado.

Datos fuente

al, la generación de ROS, la producción de SEAP y la viabilidad celular se analizaron después de tratar las células con H2O2 (ac), oltipraz (df), dibromuro de diquat (gi) o aspirina (jl), a las concentraciones indicadas. La viabilidad celular se midió mediante incubación con 50 μg/ml de resazurina durante 2 h a 37 °C. Las muestras marcadas como DC (barras naranjas) en todos los paneles representan el control positivo (estimulación a 5 voltios DC durante 20 s). Cada columna representa la media ± DE de los cuatro puntos de datos indicados. Los símbolos en (c), (f), (i) y (l) representan la media ± DE de 4 determinaciones. MFI: intensidad media de fluorescencia. Los valores de p se calcularon entre el grupo estimulado y no estimulado.

Datos fuente

a, Modelo esquemático de la configuración de tres electrodos, con un potenciostato conectado a un electrodo de referencia Ag/AgCl y dos electrodos de platino, de los cuales uno sirve como electrodo de trabajo y el otro como contraelectrodo. b,c, Voltamograma cíclico (CV) en solución estándar de hexacianoferrato (III) de potasio (K3Fe(CN)6) (10 mM, negro) o en medio de cultivo (DMEM más FBS al 10 %, rojo) en la ventana de potencial de −0,3 a 0,6 V (b) y −5,0 a 5,0 V (c). Todos los CV se escanearon a una velocidad de 10 mV s-1. df, cuantificación de ROS en medio de cultivo libre de células (d), cultivos de células HEK-293 diseñados con DART (e) y cultivos de células hMSC-TERT diseñados con DART (f). RFU, unidades relativas de fluorescencia. g, h, SEAP producido por células HEK-293 diseñadas con DART (g) y células hMSC-TERT diseñadas con DART (h), 24 h después de la electroestimulación. i, j, Viabilidad de células HEK-293 diseñadas con DART (i) y células hMSC-TERT diseñadas con DART (j), 24 h después de la electroestimulación. Todas las estimulaciones se realizaron con el sistema de tres electrodos, durante 10 o 20 segundos a los voltajes indicados. Los puntos de datos representan la media ± DE; norte = 4.

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a, diagrama de Venn de las diferencias de expresión génica entre células no estimuladas (NS) y células electroestimuladas a 5 voltios CC durante 10 s (TA) o 25 s (TB). El número total de transcripciones secuenciadas fue 61487. b, Niveles de expresión génica en TA versus NS. Las transcripciones expresadas diferencialmente se muestran en naranja. c, Niveles de expresión genética en TB versus NS. Las transcripciones expresadas diferencialmente se muestran en verde. d, Niveles de expresión génica en TA versus TB. e, Mapa de calor de las 500 transcripciones principales con la mayor desviación estándar de los recuentos de expresión entre células no estimuladas (NS) y células electroestimuladas a 5 voltios CC durante 10 s (TA) o 25 s (TB). Cada grupo contiene tres réplicas. N1, N2 y N3 son las muestras del grupo NS. El T1, T2 y T3 son las muestras del grupo TA. El T4, T5 y T6 son las muestras del grupo TB. Las 500 transcripciones principales se enumeran ordenadas de mayor a menor en la Lista complementaria. Los datos del mapa de montón fueron analizados por PCAtools en R. f, Mapa de calor de genes de interés (450 genes). T1, T2 y T3 están muy agrupados con N1, N2 y N3, respectivamente. Los grupos de genes están indicados por colores. Las anotaciones del mapa de calor son las mismas que en (e). Los detalles de la agrupación de cada gen se enumeran ordenadamente de arriba a abajo en la Lista complementaria. Las transcripciones expresadas diferencialmente se muestran en rojo. Los niveles de expresión medios (n = 3) se muestran como logaritmos naturales en (b), (c) y (d). En (e) y (f), el color en el mapa de calor indica los niveles de expresión. Los datos representan log(e) de lecturas de secuenciación asignadas a genes.

CA, se utilizaron una (a), dos (b) y tres (c) pilas alcalinas AAA Duracell o Energizer, cada una de las cuales proporcionaba alrededor de 1,5 voltios. d, Una pila de botón de litio Duracell o Energizer CR2032 proporciona aproximadamente 3 voltios. ef, cuatro pilas alcalinas Duracell o Energizer AA (e) y AAA (f) proporcionan alrededor de 6 voltios. g, Un banco de energía de Belkin cuyo puerto universal USB-A de 2,4 A proporciona hasta 5 voltios. h, Cargadores de teléfonos móviles Apple y Huawei. El cargador se conectó directamente a la red eléctrica y se cortaron los cables del cargador para conectarlos a los electrodos sumergidos en el medio de cultivo. i, Una batería alcalina Duracell o Energizer de 12 voltios y 23 amperios. j, Dos pilas alcalinas tipo bloque Duracell o Energizer de 9 voltios. k, Dos pilas alcalinas Duracell o Energizer de 12 voltios y 23 A. l, Dos baterías Exell A220/504 A proporcionan alrededor de 30 voltios. Los niveles de SEAP en los sobrenadantes del medio de cultivo se midieron 24 h después de la electroestimulación durante el tiempo indicado. Cada columna representa la media ± DE de los cuatro puntos de datos indicados. Los valores de p se calcularon entre el grupo estimulado y no estimulado.

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a, Diseño de construcciones de ADN utilizadas para las líneas celulares monoclonales. El sistema DART se basa en la expresión constitutiva de KEAP1 (ITR-PhCMV-KEAP1-P2A-BlastR-pA-ITR, pJH1054) y NRF2 (ITR-PhCMV-NRF2-pA:PRPBSA-ECFP-P2A-PuroR-pA-ITR , pJH1101), y cuatro reporteros SEAP controlados por ARE (DART4) en tándem seguidos de insulina de ratón (mINS) (ITR-PDART4-SEAP-P2A-mINS: PmPGK-ZeoR-pA-ITR, pJH1169). Todas las construcciones están flanqueadas por repeticiones terminales invertidas (ITR) para el reconocimiento de la transposasa Sleep Beauty basada en SB100X. b, c, Detección de líneas celulares monoclonales HEK-293 (b) y hMSC-TERT (c). Se transfectaron de forma estable células HEK-293 o hMSC-TERT con pJH1101, pJH1054 y pJH1169. Se seleccionaron aleatoriamente treinta líneas celulares monoclonales para perfilar la expresión de SEAP 24 horas después de la electroestimulación a 4,5 voltios CC durante 20 s. En (c), el rectángulo azul indica la mejor línea celular monoclonal de su clase, DCINS, que fue seleccionada para experimentos de seguimiento. Las líneas celulares monoclonales se cultivaron y seleccionaron en medio suplementado con puromicina (2,5 μg/mL), blasticidina (10 μg/mL) y zeocina (100 μg/mL). Los datos en (b) y (c) son media ± DE; norte = 2; Los valores de SEAP se normalizaron por números de celda. dg, Análisis de niveles de proteína y ARNm de NRF2 y KEAP1 en células parentales y diseñadas con DART. d, e, Niveles relativos de ARNm de KEAP1 (d) y NRF2 (e) en células parentales (hMSC-TERT) y células DCINS derivadas, analizados mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Cada columna representa la media ± DE de los cuatro puntos de datos indicados. f,g, análisis de transferencia Western de las proteínas KEAP1 (f) y NRF2 (g) en células parentales (hMSC-TERT) y células DCINS derivadas. Se cargó la misma cantidad de lisado celular en el gel y se usó la proteína constitutiva actina como control de carga. Los experimentos se repitieron de forma independiente con resultados similares en dg. Los valores de p se calcularon entre el grupo estimulado y no estimulado o los grupos indicados.

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Los niveles de HbA1c en la sangre de ratones de tipo salvaje y de ratones con diabetes tipo 1 no estimulados y electroestimulados se midieron semanalmente durante seis semanas consecutivas después de la implantación de células DCINS encapsuladas en alginato. b,c, Electroestimulación de ratones con electrodos adhesivos conductores de electricidad. b, Imagen de un ratón con electrodos adhesivos conductores unidos al sitio de implantación a una distancia de 6 mm (círculo negro). c, Se registró la glucemia en ayunas antes de la implantación (día 0) y durante los cuatro días posteriores a la implantación de células DCINS en tres grupos de ratones con diabetes Tipo 1, es decir, ratones estimulados con 4,5 voltios CC durante 10 s en el sitio de implantación, con parches adhesivos en la piel de arriba. el sitio de implantación (estimulado con parche adhesivo, verde) o agujas de acupuntura de platino (estimuladas, rojas) y ratones "no estimulados" (azul). También se utilizaron como controles ratones de tipo salvaje (negros) y ratones con diabetes tipo 1 sin implantes (control negativo, gris). Este experimento no se repitió. d, e, Administración de inhibidores de enzimas generadoras de ROS y eliminadores de ROS a ratones T1D implantados con DART. Niveles de glucosa (d) e insulina (e) en sangre en ratones estimulados y no estimulados, a los que se les inyectó por vía subcutánea un eliminador de ROS (NAC, 600 mg/kg) o inhibidores de enzimas generadoras de ROS (GKT136901, 50 mg/kg; AEBSF, 0,6 mg/kg) en el sitio de implantación, 30 min antes de la electroestimulación (DC 4,5 voltios durante 10 s). Se recogieron muestras de sangre para su análisis 4 días después de la implantación. Los puntos de datos representan la media ± DE; norte = 5; los valores se normalizaron al grupo de tipo salvaje. El análisis estadístico se realizó entre: en (a), grupos estimulados y no estimulados (azul), y grupos estimulados y de tipo salvaje (negro); en (c), estimulado y no estimulado con parche adhesivo (verde), estimulado y estimulado con parche adhesivo (rojo); en (d) y (e), grupo estimulado y no estimulado.

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Se midieron los niveles de ac, IFN-γ (a), IL-6 (b) y TNF-α (c) en el suero de ratones T1D no estimulados y estimulados, en los momentos indicados después de la implantación de células DCINS encapsuladas en alginato. . d, Análisis de pH sanguíneo. Se recogieron muestras de sangre de tres grupos (ratones T1D de tipo salvaje, no estimulados y T1D estimulados) 3 minutos después de la electroestimulación con CC de 4,5 voltios durante 10 s. c, La prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal (GTT) se realizó después de 8 h de ayuno mediante la administración de 1,5 g/kg de D-glucosa acuosa a ratones el día 3 después de la implantación de células microencapsuladas. Se tomaron muestras de sangre en los momentos indicados. Los puntos de datos representan la media ± DE; en (a), (b), (c), (e), n = 5; en (d), n = 10; en (d) y (e), los valores se normalizaron al grupo de tipo salvaje. En (a), (b), (c), se realizó un análisis estadístico entre los grupos estimulados y no estimulados; en (d), el análisis estadístico se realizó entre el grupo de tipo salvaje y el de diabetes Tipo 1; en (e), el análisis estadístico se realizó entre grupos estimulados y no estimulados (azul), y grupos estimulados y de tipo salvaje (negro).

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anuncio, se midieron los niveles de insulina (a), cetona (b), triglicéridos (c) y glucagón (d) en el suero de ratones con diabetes tipo 1 estimulados y no estimulados de tipo salvaje el día 4 después de la implantación de DCINS encapsulado en alginato. células. Los animales estimulados fueron electroestimulados consecutivamente durante tres días a 4,5 voltios CC durante 10 s. El día 4, se realizó electroestimulación a las 6 am y luego los animales se mantuvieron en ayunas durante 6 h. Las muestras de sangre se tomaron en los momentos indicados. No hay diferencias notables entre los grupos de tratamiento electroestimulados y de tipo salvaje en ningún momento. A las 6 am, se recogieron muestras de sangre inmediatamente después de la electroestimulación y se perfilaron para determinar la insulina en sangre y los biomarcadores de deficiencia de insulina. Los perfiles correspondientes de los niveles de glucosa en sangre se muestran en la Fig. 5g. Los puntos de datos representan la media ± DE, n = 5; los ratones fueron monitoreados una vez; los valores se normalizaron al grupo de tipo salvaje. Los valores de P se calcularon entre los grupos estimulados y no estimulados.

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Después, los ratones con diabetes tipo 1 fueron electroestimulados utilizando varios voltajes durante diferentes períodos de tiempo. Se midieron los niveles de af, cetona (a,b), triglicéridos (c,d) y glucagón (e,f) en el suero de ratones T1D de tipo salvaje, estimulados y no estimulados el día 4 después de la implantación de DCINS encapsulado en alginato. células. Los grupos estimulados fueron electroestimulados consecutivamente durante tres días a los voltajes indicados durante los períodos de tiempo indicados. Dos, tres, cuatro y cinco baterías AA proporcionaron CC 3,0, 4,5, 6,0 y 7,5 voltios, respectivamente. Un bloque de 9 V proporcionó 9,0 voltios CC. Las muestras de tipo salvaje procedían de dos grupos diferentes de ratones sin ningún tratamiento. Las muestras de sangre se tomaron antes del ayuno el día 4. Los perfiles correspondientes de los niveles sanguíneos de glucosa e insulina se muestran en las figuras 6a-d. gj, perfilado de biomarcadores de deficiencia de insulina en suero de ratones con diferentes tiempos de inducción. g, Horario de electroestimulación con diferentes frecuencias y ciclo de ayuno-alimentación para todos los ratones durante todo el experimento. Se midieron los niveles de hj, cetona (h), triglicéridos (i) y glucagón (j) en el suero de ratones T1D estimulados y no estimulados de tipo salvaje el día 4 después de la implantación de células DCINS encapsuladas en alginato. Los grupos estimulados fueron electroestimulados consecutivamente durante tres días a 4,5 voltios CC durante 10 s con las frecuencias de inducción indicadas. Las muestras de sangre se tomaron el día 4 en los momentos indicados. Los perfiles correspondientes de los niveles sanguíneos de glucosa e insulina se muestran en las figuras 6e, f, respectivamente. El análisis estadístico se realizó entre grupos no estimulados y estimulados o grupos indicados. Las designaciones estadísticas con diferentes colores en (h)-(j) se refieren a los puntos de datos correspondientes con el mismo color. Los puntos de datos representan la media ± DE; norte = 5; el experimento se realizó una vez; los valores se normalizaron al grupo de tipo salvaje.

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Higos suplementarios. 1 a 10, vídeos complementarios 1 a 3, tablas complementarias 1 a 8, lista complementaria y referencias complementarias.

Lista complementaria. Archivo de Excel que contiene cuatro pestañas. Lista S1: perfil de expresión genética para datos de secuencia de ARNm (información de análisis genético para datos ampliados, figuras 4a a f); Lista S2: lista general de mapas de calor, 500 principales (información de análisis genético para datos extendidos, figura 4e); Lista S3: genes relacionados con antioxidantes en humanos (información de análisis de genes para datos ampliados, figuras 4a a f); y Lista S4: lista de agrupamiento de niveles de expresión entre genes relacionados con antioxidantes (información de análisis de genes para datos extendidos, figura 4f).

Aplicar electroestimulación a células diseñadas por DART en la incubadora. Se utilizó una fuente de energía eléctrica para aplicar CC de 5 voltios durante 10 s. La electroestimulación se realizó en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% de CO2. Se sembraron células HEK293 en una placa de 24 pocillos y se transfectaron con pJH1003, pJH1004 y pJH1005. Para aumentar el contraste, se colocó un papel blanco debajo del plato. Los pocillos de la primera, tercera y quinta columnas son los grupos de control sin electroestimulación y los pocillos de la segunda, cuarta y sexta columnas son los grupos electroestimulados (DC 5 voltios durante 10 s). Las células se mantuvieron en la incubadora durante el proceso de recuperación.

Registro de intensidad de fluorescencia de células HEK293 no estimuladas diseñadas por DART. Se transfectaron células HEK293 con pJH1003, pJH1004 y pJH1214 (PDART-slGFP-pA). El vídeo se grabó en un sistema microscópico Zeiss LSM 980 Airyscan después de cultivar las células durante 72 h sin ningún estímulo.

Registro de intensidad de fluorescencia de células HEK293 electroestimuladas diseñadas por DART. Se transfectaron células HEK293 con pJH1003, pJH1004 y pJH1214 (PDART-slGFP-pA). El vídeo se grabó en un sistema microscópico Zeiss LSM 980 Airyscan después de cultivar las células durante 72 h tras una estimulación con CC de 5 voltios durante 20 s.

Datos de fuente estadística.

Datos de fuente estadística.

Datos de fuente estadística.

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Datos de fuente estadística.

Datos de fuente estadística.

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Geles de transferencia Western sin procesar.

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Reimpresiones y permisos

Huang, J., Xue, S., Buchmann, P. et al. Una interfaz electrogenética para programar la expresión de genes de mamíferos mediante corriente continua. Nat Metab (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00850-7

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Recibido: 28 de abril de 2023

Aceptado: 23 de junio de 2023

Publicado: 31 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42255-023-00850-7

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